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NMR-Untersuchung zur globalen Dynamik des G-Protein gekoppelten Neuropeptids Y-Rezeptor Typ 2 in 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin-Membranen

  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Gruppe von Membranproteinen mit sehr dynamischer Eigenschaft, die für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase auf-grund ihrer vielfältigen Wirkungsweise im menschlichen Körper unerlässlich ist. So ist es wichtig, nicht nur den strukturellen Aufbau dieser Rezeptoren zu kennen, sondern auch ihre dynamischen Eigenschaften zu verstehen. In den letzten Jahren wurden viele Kristallstruktu-ren von GPCRs bekannt, die aber lediglich eine Momentaufnahme darstellen. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, mit dem Neuropeptid Y-Rezeptor Typ 2, ein besseres Verständnis über die molekulare Beweglichkeit innerhalb seiner Umgebung zu erlangen. Dies soll als Grundlage dienen, um künftig die Wechselwirkung mit einem Agonisten besser beurteilen zu können. Der Y2-Rezeptor spielt bei neuronalen Funktionen, wie z.B. Ängsten und Suchterkrankungen, eine wichtige Rolle. Für die Untersuchung der Dynamik des Rezeptors wurde dieser in verschiedene Modell-membranen, bestehend aus einfach-ungesättigten Phospholipiden, rekonstituiert und an-schließend mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie untersucht. Da die Lipidumgebung einen großen Einfluss auf die Struktur und Dynamik der Rezeptoren ausübt, wurde zusätzlich der Einfluss von Cholesterol, Phosphatidylethanolamin oder negativ geladenen Phosphatidylserin als Bestandteile der Modellmembran auf den Y2-Rezeptor untersucht. Zudem wurde durch selektive Unterdrückung von Signalen durch paramagnetische Manganionen und Spin-markierten Lipiden die Dynamik einzelner Bereiche näher untersucht (sog. quenching). Zur Quantifizierung der Dynamik wurde das Verhältnis von bewegungsgemittelter und vol-ler dipolarer Kopplung für den H-C Bindungsvektor als Ordnungsparameter dargestellt. Dieser reicht von 0 (isotrop beweglich) bis 1 (starr). Statische 15N-NMR-Spektren und quantitative 1H-13C Ordnungsparameter Bestimmungen, durch 1H-13C dipolare Kopplungsmessungen der CH-, CH2-, und CH3-Gruppen, offenbarten für den gesamten Rezeptor axial-symmetrische Bewegungen in der Membran und molekulare Fluktuationen mit verschiedensten Amplituden aller Segmente. Ordnungsparameter (SRückgrat = 0,65 ± 0,04, SGly = 0,56 ± 0,04, SCH2 = 0,26 ± 0,02 - 0,40 ± 0,03, SCH3 = 0,20 ± 0,02) aus den direkt polarisierten 13C-MAS-NMR-Experimenten zeigten, dass der Rezeptor in den Membranen höchst beweglich ist und im Mittel die Bewegungsamplituden des Rückgrats bei ~40°-50° und für die Seitenketten bei ~60°-70° liegen. Interessanterweise zeigt der Neuropeptid Y-Rezeptor Typ 2 eine geringfügig höhere Rigi-dität in der einfach-ungesättigten Phospholipidmembran, im Gegensatz zur gesättigten Membran. Das könnte mit der gesteigerten Kettenlänge der einfach-ungesättigten Lipide und der damit einhergehenden Streckung des α-helikalen Anteils des Rezeptors zusammenhän-gen. Die unterschiedliche Lipidkomponenten in den Modellmembranen zeigten hingegen keinen signifikanten Einfluss auf den Y2-Rezeptor. Es konnte zudem gezeigt werden, dass durch gezieltes Quenching der Loops und Termini des Rezeptors der transmembrane helikale Anteil eine höhere Rigidität besitzt (SRückgrat = 0,70 ± 0,05, SGly = 0,65 ± 0,04, SCH2 = 0, 28 ± 0,02 - 0,40 ± 0,03, SCH3 = 0,21 ± 0,02). Die Unterdrückung der Signale des transmembranen Bereiches offenbarten einen tendenziellen Anstieg der Ordnungsparameter um ≤ 7% für die Segmente des Rückgrates. Das könnte an einer zu geringen Konzentration der Spin-markierten POPC-Lipide liegen, wodurch es lediglich zu einer Unterdrück der mobilen Sei-tenketten der α-Helices kommt.
  • G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute a group of membrane proteins with highly dynamic properties, which are required in the receptors function as sophisticated parts in cell communication and maintaining homeostasis. For several years, structure information became available by crystallization, which gives just a static snapshot without dynamical properties. Therefore, investigations of the native-like environment of molecular motions of the neuropeptide Y-receptor type 2 are important for understanding, such as the interaction with an agonist. The neuropeptide Y-receptor typ 2 influences neuronal functions like anxiety and addictive disorders. Here, the receptor was reconstituted into a model membrane composed of monounsatu-rated phospholipids and solid-state NMR was used to characterize its dynamics. Since the lipid environment exerts a major influence on the structure and dynamics of the receptors, therefore investigations were made with different membrane components as in cholesterol, phosphatidylethanolamine, or negatively charged phosphatidylserine. Additionally, investiga-tions in molecular motions by regio-selective suppression of signals in the presence of man-ganese ions and spin-labeled lipids were another point of this work. To quantify the dynamical character of Y2-receptor, order parameters represent the ratio of motionally averaged and full dipolar coupling for the H-C bond vector that ranges from 0 for isotropic mobility to 1 for rigidity. Qualitative static 15N-NMR spectra and quantitative de-terminations of 1H-13C order parameters through measurements of the 1H-13C dipolar coupl-ings of the CH, CH2 and CH3 groups revealed axially symmetric motions of the whole mole-cule in the membrane and molecular fluctuations of varying amplitude from all molecular segments. The molecular order parameters (Sbackbone = 0.65 ± 0.04, SGly = 0.56 ± 0.04, SCH2 = 0.26 ± 0.02 - 0.40 ± 0.03, SCH3 = 0.20 ± 0.02) obtained in directly polarized 13C-MAS-NMR experiments demonstrate that the Y2 receptor is highly mobile in the native-like membrane and on average the motional amplitudes of the receptor backbone and side chain reach val-ues between ~40°-50° and ~60°-70°, respectively. Interestingly, according to these results the receptor was found to be slightly more rigid in the membranes formed by the monounsaturated phospholipids than by saturated phospholi-pids as investigated previously. This could be caused by an increased chain length of the monounsaturated lipids, which may results in a higher helical content of the receptor. The incorporation of different components into a model membrane exhibits no significant influ-ence on the molecular mobility of the Y2 receptor. Furthermore, regio-selective detection of dynamic structure of transmembrane α-helical content revealed rather rigid motions than loops and termini of the neuropeptide Y2-receptor (Sbackbone = 0.70 ± 0.05, SGly = 0.65 ± 0.04, SCH2 = 0.28 ± 0.02 - 0.40 ± 0.03, SCH3 = 0.21 ± 0.02). Additionally, regio-selective suppression of transmembrane α-Helices using spin-labeled lipids reveals tendentially increase in order parameters of less than 7%. This could be due to the low concentration of spin-labeled lipids, whereby only site-chains of α-helices are suppressed.

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Metadaten
Author:Julian Kahr
Advisor:Hans-Dieter Schnabel
Document Type:Bachelor Thesis
Language:German
Name:Institut für Medizinische Physik und Biophysik
Härtelstraße 16-18, 04107 Leipzig
Date of Publication (online):2018/02/22
Year of first Publication:2015
Publishing Institution:Westsächsische Hochschule Zwickau
Date of final exam:2015/02/20
Release Date:2018/02/22
Tag:Fluktuationen; Membranproteine; NMR-Spektroskopie; Ordnungsparameter; Quenching
Page Number:46 Seiten, 20 Abb., 9 Tab., 74 Lit.
Faculty:Westsächsische Hochschule Zwickau / Physikalische Technik, Informatik